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液相色谱技术对蛋白质分离的应用

   　　以shotgun技术为代表的液相色谱技术路线在对未知蛋白质的大规模鉴定尤其是低丰度蛋白质鉴定方面有很强的优势,但是这种基于肽段分离的技术在分析中忽略了很多完整蛋白质的信息(包括翻译后修饰方面的信息)。为了弥补或提高此路线对翻译后修饰蛋白质的检测能力,Yates与其合作者们采用了一些蛋白质酶解的新方法,即采用多种不同的酶对蛋白质进行酶解从而产生重叠的肽段。
　　例如,胰蛋白酶对蛋白质进行特定位点的酶解,而其他两种酶进行非特异性的酶解;然后利用酶解产生的重叠肽段统计分析完整蛋白质的信息。但这种方法应用起来非常繁琐复杂。相比之下,双向凝胶电泳为代表的“top-down”
　　技术路线在保留完整蛋白质信息方面有着特有的优势。如何让液相色谱技术实现“top-down”的路线,即用液相色谱技术实现对完整蛋白质的直接分离分析,让它既保持其固有的测定蛋白质物理化学性质的优势,又能够兼具“bottom-up”技术对未知蛋白质的鉴定尤其是规模鉴定的优势,是色谱工作者的新课题,也是蛋白质组学研究技术领域的又一大挑战。针对这个问题国内外的一些实验室进行了探索,典型的是采用离线的方式,即利用多维液相色谱技术直接分离完整蛋白质。
　　较早采用的是以制备级等电聚焦电泳作为第一维,以反相液相色谱为第二维的联用系统实现对蛋白质的分离。Lubman及其合作者使用Rotofor液相等电聚焦电泳仪对细胞裂解液中的蛋白质一次性进行等电聚焦,然后以rplc作为第二维进行分离。该方法在自动化和通量方面比双向凝胶电泳技术有着明显的优势。VerBerkmoes及其合作者运用阴离子交换色谱作为第一维色谱对酵母细胞的蛋白样品进行分离,所得每一个馏分都被分为两份,一份酶解后由质谱鉴定,另一份利用电喷雾傅里叶变换离子回旋共振质谱进行相对分子质量的测定,两组结果对照起来对目标蛋白质进行分析,在完成对未知蛋白质鉴定的同时得到了蛋白质的分子量等信息。